1. 概述
光电二极管阵列检测器(PDA/DAD)是HPLC应用最多的一款通用型检测器，其光路系统基本结构由光源，透镜组，滤光装置，流通池，聚焦透镜，狭缝，光栅，光电二极管阵列(详见图1)。
Fig. 1 Optical system for PDA/DAD detector
其中光源常用有氘灯(紫外光源)以及钨灯(可见光源)，透镜组起光源聚焦作用，狭缝以及光栅起分光作用，二极管则起到光电转换作用。
1.1 光电二极管
光电二极管部分一般由512或1024个二极管线性或多组排列在晶体硅上，负责接收由光栅分光之后的光信号，并将光信号转换为电信号暂时存储，达到电量存储阈值经由传输系统最终转换为电讯号而输出(光电转换见图2)，其中光电二极管可设置的时间常数(Response time)是个很有用的参数。
Fig. 2 Photoelectric conversion circuit for PDA/DAD detector
光电二极管所接收的光强度信号是通过测量固态线路开关连接到公共输出线上的存储电容器的电荷量传导的。这些开关由一个寄存器控制，在二极管接收到光信号之前，电容器是电量满载的，在每一次测量周期开始时，由于光照射二极管，产生入射光二极管电流，引起电容器定量地释放一定的电量，之后给电容器重新充电的电流量正比于放电所需的光强度，最终实现光电的转换。
一般地，单个光电二极管的分辨率一般为0.7-1.2 nm，光电二极管的个数越多，每个二极管的检测光谱带宽就相应的更小，检测器的功能越强大，其光谱的分辨率也就越高。
1.2 滤光装置
滤光装置用于滤除高频光源噪音，滤光的强弱可通过设置滤光时间常数设置，一般地，该时间常数越大峰高越低但基线噪音显著降低；虑光时间常数愈小，峰型愈窄，峰高愈高，但基线噪音亦会显著增加，造成S/N变小(如下图3)。
此外从图中还可以看到，过大的滤光时间常数，会影响色谱峰的表观分离度，因此在实际设置时需要综合考虑峰高，峰型，基线噪音以及色谱峰分离度因素，对滤光时间常数做出合理的设置。
对于滤光时间常数的设置，可在根据方法需要确定采样速率（x）之后进行相应的优化，可将起始的虑光时间常数设置为1/x，之后根据需要进行调整：若分析方法用于微量或痕量物质的定量，需要足够大的信噪比，可相应地调大滤光时间常数；若以表观分离度为目的，则相应的调小滤光时间常数(值得注意的是，若样品本身经色谱柱分离之后，未能将待分析物基线分离，无论怎么调整都是无法实现表观分离度＞1.5的)
1.3 流通池
流通池也即是样品对入射光发生光吸收的部分，其体积从小于1 微升到十几微升不等，具体分类如下表1。
Tab. 1 Category of flow cell
流通池的选择需要根据所使用的色谱柱的内径来定，一般地内径越小，流通池的体积也就应越小，否则分析物从色谱柱内部流出到流通池时，发生溶剂积增大效应，导致产生很大的柱外体积效应(色谱峰变宽，造影变大)，亦会影响分离度。在根据色谱柱以及仪器选择流通池的体积时，可按照“流通池体积≤最早流出峰的洗脱体积的十分之一为宜”的原则进行选择。一般地，13微升流通池适用于内径4.6 mm色谱柱，5微升流通池适用于内径3 mm色谱柱，2微升流通池适用于内径2.1 mm色谱柱。此外流通池的选择，除了选择尽可能小体积之外，也应该选择长度尽量大的流通池，原因如下图4。
光线进入流通池之后发生多次反射，而增加了样品对于光能量的吸收，从而使得吸收度变大，同时也提高了信噪比。不同规格的流通池对于色谱峰的检测效率以及信噪比的影响可参考下表2。
Tab. 2 Effect of flow cell specification on chromatographic performance
此外流通池内部控温功能为可选项，一般我们需要选择流通池内部控温模式，其目的在于减少由于室温变化引起的基线噪音异常波动，这一点对于环境温度变化比较大的时候，使用PDA检测器来说异常重要(如下图5)。
Fig. 5 Temperature control in the flow cell
1.4 光栅
光栅是由大量等宽等间距的平行刻痕构成的光学器件(grating)。刻痕为不透光部分，两刻痕之间的光滑部分可以透光。一般地，光栅的宽度越大，单位长度上刻痕数越多，其分光光谱分辨率也就越大，精制的光栅，在1cm宽度内刻有几千条乃至上万条刻痕。
光栅分为透射光栅(利用透射光衍射/干涉分光)和反射光栅(利用反射光衍射/干涉分光)，用得较多的是反射光栅。光栅是一种多狭缝元件，光栅光谱的产生是单狭缝衍射和多狭缝干涉两者联合作用的结果，单狭缝衍射决定谱线的强度分布，多狭缝干涉决定谱线出现的位置，简单分光原理如下图6所示。
Fig. 6 Principle of a grating
不同的波长的光线，其干涉的角度不一样，单狭缝衍射和多狭缝干涉的结果就是将复色光分解为一个扇面的多单色光，进而被光电二极管检测到。
2. 紫外吸收光谱与DAD/PDA检测器
光谱是化合物本身所固有的特性，一般地，含有不饱和化学键，芳香基团，以及含有杂原子的功能基团，其未成共价键的电子轨道内的电子可受光能量的激发而发生跃迁。非共价电子轨道具有较宽泛的振动，转动以及电子能级，因而形成比较宽的吸收光谱。
化合物的吸收光谱不仅受到化合物本身性质的影响，在HPLC中所使用的流动相的种类亦会影响化合物的吸收光谱。当化合物受到溶剂极性和酸/碱性等的影响时，溶质吸收峰的波长、强度以及形状均可能发生不同程度的变化。这是因为溶剂分子和溶质分子间可能形成氢键，或极性溶剂分子的偶极使溶质分子的极性增强，跃迁能量发生变化，因而吸收波长，强度以及吸收光谱的形状发生变化。
2.1 紫外吸收光谱朗伯比尔定律
朗伯比尔定律(Beer-Lambert Law)：入射光被透明介质吸收的比例与入射光的强度无关，在光程方向上等距离吸收介质引起光吸收度相等，其数学表达式为A= Kbc，A为吸光度，K为摩尔吸收系数，它与吸收物质的性质及入射光的波长有关，c为吸光物质的浓度，b为吸收层厚度。化合物对于特定波长光的吸收度与化合物的浓度呈正比关系，这也是紫外吸收光谱仪以及DAD/PDA检测器进行线性定量的基础。
在实际应用该关系式进行相关物质定量时，需要对方法的线性定量范围进行测定，因为吸收度与浓度之间的关系并不总是呈线性相关的，如下图7所示。
Fig. 7 Absorbance as a function of concentration
在以DAD/PDA检测器作为HPLC的检测器，进行定量方法开发的时候，除了需要考虑线性范围之外，还需要考虑所使用流动相的截止波长，检测波长等。一般地，检测波长需大于流动相的截止波长10-20 nm左右，以尽可能地减少基线噪音，降低方法定量限，这点对于痕量检测尤其重要。
对于检测波长的设置，除了需要大于流动相的截止波长10-20 nm之外，最好选择化合物的最大/最低特征吸收波长。这是因为，被测组分的灵敏度最高，吸收光谱峰值附近斜率要比其他的区域要小，波长偏差Δλ对应的吸光度偏差ΔA也比别的区域要小，减小分析误差(也可参照下述光谱带宽进行理解，当带宽设置足够小时，其他吸收波长作为检测波长也是可以满足需求的，但可能会引起其他方面的问题)。
2.2 光谱相关概念
含有单一发色基团时，经光栅色散之后的化合物的吸收光谱强度轮廓满足高斯分布(如下图8)。
Fig. 8 Gaussian intensity distribution of wavelengths
与DAD/PDA应用最为密切的几个光谱相关概念有光谱带宽(光谱半峰高处光谱宽度)，光谱狭缝宽度(光谱半峰高处两条切线与X轴交点之间宽度)，物理狭缝宽度，分辨率(每一光电二极管的采样波长范围，主要受物理狭缝宽度的影响)，DAD检测峰宽，DAD响应时间常数，采样频率以及参比波长等。
2.2.1 光谱带宽
光谱带宽概念与DAD/PDA检测器在检测波长处的吸光度响应息息相关，如检测波长设置为250 nm，光谱带宽设置为20 nm，检测器吸光度取值处于240-260 nm范围内。光谱带宽设置的大小影响信噪比，色谱峰高度，以及色谱峰表观分离度。
光谱带宽设置越大，实际检测波长范围涉及的光电二极管的个数也就越多(如带宽设置20 nm，光电二极管分辨率1 nm，涉及的光电二极管个数为20个)，实际检测到的吸收度平均值以及基线噪音也随之降低，但基线噪音降低效果更加显著(如图9A,9B)。
Fig. 9A Influence of bandwidth on signal/noise
Fig. 9B Influence of bandwidth on signal/noise
随光谱带宽的增加，涉及的光电二极管数目亦会随之增加，检测器实际检测波长范围吸收度响应平均化程度也会增加，导致检测器的光谱分辨率(区别与光电二极管分辨率)降低，对依靠吸收光谱对化合物进行初步鉴别带来困难(如图10)。
Fig. 10 Influence of bandwidth on spectral resolution
因此，在对DAD/PDA检测器光谱带宽参数进行设置的时候，需要考虑方法的应用目的，若是需要根据化合物的吸收光谱对化合物的结构进行初步判断，则需要将带宽设置小一些(2-4 nm)；若方法应用与痕量检测，需要较大的信噪比，则须将带宽尽可能设置大一些(20-30 nm)，带宽对于信噪比以及检测器分辨率的综合影响可参照下表3。
Tab. 3 Influence of bandwidth on signal/noise and spectral resolution
一般地，将光谱带宽设置为10 nm，可基本满足大多数的分析方法需要(此处需要区别UV光谱仪带宽一般设置为自然带宽的十分之一)。此外，光谱带宽仅是影响色谱图上表观分离度而不会影响不同分析物经色谱柱分离之后的实际分离度。
2.2.2 狭缝宽度
比较窄的狭缝宽度，有利于提高DAD光电二极管的分辨率，对于依靠比对紫外吸收光谱鉴别化合物有利；比较宽的狭缝宽度，则允许更多的光透过狭缝经由光栅发生色散而被光电二极管检测到，其结果是检测到的信号强度增加，基线噪音相对减小，检测器的灵敏度增加，但伴随DAD光电二极管的分辨率降低(如图11A,11B)。
Fig. 11A Influence of slit-width on signal/noise
Fig. 11B Influence of slit-width on spectral resolution
当狭缝宽度增加时，透过狭缝入射到光栅上的光线区域增加，同一区域内的光电二极管接收到的波长范围变宽，导致每一光电二极管接收的是若干波长的光而不是单一波长光，因此导致对于光谱的分辨率降低。当狭缝宽度减小时，透过狭缝的光减少，光谱强度变弱，基线噪音变大，检测器的灵敏度降低。
对于基线噪音，取的是光谱带宽范围内的所有光电二极管转换的多色光对应的吸收度平均值的平均值。狭缝宽度对于信噪比以及检测器光谱分辨率的综合影响可参照下表4。
Tab. 4 Influence of slit-width on signal/noise and spectral resolution
2.2.3 响应时间，采样频率以及峰宽
响应时间表述的是光电二极管对于流通池内吸收度的突然变化的响应速度。响应时间设置小的时候，单位时间内检测器采点数增加(采样频率)，描绘出的色谱峰越能反映真实情况，色谱峰高度以及基线噪音同时提高(基线噪音更加显著)。响应时间设置大的时候，单点重复采取次数增加(基线噪音反比于单点重复采取次数的平方根)，单位时间内检测器采点数减少，色谱峰高度以及基线噪音同时减少(基线噪音更加显著)，如下图12。
Fig. 12 Influence of response time on peak height and signal/noise
一般地，响应时间减少为原来的一半时，色谱峰高度增加约5%，但基线噪音则增加为原来的140%。
一个完整的色谱图需要20-25个点，方可满足对于精确定量的需求，此外采样点数的多少还会影响色谱图上各色谱峰高度以及色谱峰之间的表观分离度，如下图13所示。
Fig. 13 Influence of sample rating on peak height and resolution
如上图所示，当由于采样频率引起色谱峰分离度较差，峰高较低时，可适当增大采样频率来改善这种状况(如果色谱柱本身无法做到对待分离组分做到有效分离，该方法并无裨益)。
峰宽是色谱峰半峰高处宽度，一般依据色谱图中最窄色谱峰的峰宽进行设置，而响应时间一般设置为峰宽的1/5至1/3为宜，采样频率一般可根据需要进行调整。对于相关设置，一般参照下表5。
Tab. 5 Selectivity of peak width, response time and sample rating
2.2.4 参比波长
设置合适的参比波长可有效补偿流动相折光率变化的影响，可以有效减小基线波动以及噪音水平(如图14A所示)，提高信噪比。特别是在使用HPLC梯度洗脱模式的时候，流动相随着梯度的不断变化，其折光率亦不断改变，造成背景噪音过大(如图14B所示)。
Fig. 14A Influence of reference wavelength on baseline noise
Fig. 14B Influence of reference wavelength on baseline noise
参比波长设置越靠近检测波长，基线噪音水平越低；但同时会损失一定峰高。一般地，参比波长带宽设置为100nm左右，参比检测波长范围起始点以分析物吸收光谱上吸收度小于 mAu的波长加10nm为宜(如下图15所示)。
Fig. 15 Selectivity of reference wavelength
3. DAD/PDA检测器综合设置
对于DAD/PDA检测器的综合设置可按照下表6进行相应设置，也可根据需要进行相关参数的调整。
Tab. 6 comprehensive setting of a DAD/PDA detector
4. 结论
DAD/PDA检测器作为HPLC应用范围最广的通用检测器，合适的设置对于获得高质量的色谱图以及精确的分析结果至关重要。根据需要对检测器的一个或多个相关参数进行优化设置也应该是HPLC方法开发的组成部分，以开发出符合期望甚至超出期望的分析方法。
作者信息
Bruce Lee
作者微信号：Lindaring001
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